PCR反應(yīng)組分

引 物

引物與模板配對(duì)的長度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，最高不宜超過30個(gè)核苷酸，最佳長度為20-24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5＇端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體；兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似；引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)；特別是在引物3＇端最好有富有GC，這樣退火后有利于3＇端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。

模 板

模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多，不超過1μg為宜，因?yàn)槟０辶窟^多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如：使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。

反應(yīng)緩沖液

緩沖液的PH值，鹽離子濃度、助溶劑成分等都會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM，可以適用于大多數(shù)PCR反應(yīng)，但它并非對(duì)任何模板和引物的組合都是最佳的。

酶  量

50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過少時(shí)反應(yīng)性能會(huì)下降。

PCR反應(yīng)條件

變性溫度與時(shí)間

模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性，一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，最高變性溫度不宜超過95℃。

退火溫度與實(shí)踐

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30-60秒，足以使引物與模板之間結(jié)合，沒有必要長時(shí)間退火。

延伸溫度與時(shí)間

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所有聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定。如同樣擴(kuò)增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板DNA的量，擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。