■ 產(chǎn)品介紹
DUALmembrane系統(tǒng)是DUALsystems BioTech公司開發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的檢測(cè)技術(shù)，它利用分離的泛素系統(tǒng)（split-ubiquitin）直接檢測(cè)天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前市面上唯一檢測(cè)膜蛋白間相互作用的酵母雙雜系統(tǒng)。此系統(tǒng)采用NMY51酵母菌株，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)；此菌株Transformation marker為: trp1，leu2-3，報(bào)告基因?yàn)椋篐IS3，ADE2和lacZ，第一步通過營養(yǎng)缺陷型報(bào)告基因（HIS3，ADE2）進(jìn)行選擇性生長(zhǎng)篩選，進(jìn)一步通過LacZ報(bào)告基因進(jìn)行β-半乳糖分析顯色的定量或半定量篩選，三個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因，受不同啟動(dòng)子的調(diào)控，降低假陽性幾率。原理：泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa殘基組成；泛素作為降解信號(hào)分子，可以連接另外一種蛋白質(zhì)的N端，然后被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識(shí)別，從而導(dǎo)致與泛素相連的蛋白被酶解。泛素可以人為分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub）。首先，人為地將泛素Nub的3位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI突變?yōu)?NubG）。這樣與Cub的親合力大大降低，避免了Cub和Nub自我結(jié)合或接近的可能性。其次，將Cub 部分與人工合成的 LexA-VP16 轉(zhuǎn)錄激活因子融合成一個(gè)融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常條件下 NubG不與Cub 結(jié)合，UBPs也不能識(shí)別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會(huì)被切下來。最后，將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分別與NubG和Cub融合，形成bait融合蛋（bait-cub-LexA -VP16）和prey融合蛋白（prey-NubG）。如果bait和prey發(fā)生相互作用，就會(huì)促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs識(shí)別，導(dǎo)致 LexA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。此系統(tǒng)可使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標(biāo)志均為L(zhǎng)EU；三種Prey質(zhì)粒：pPR3-C，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志均為TRP。NMY51酵母菌株可用YPDA在28℃有氧的條件下培養(yǎng)，然后使用30%的甘油保藏菌種。 |
基因型： | MATahis3Δ200trp1-901leu2-3,112ade2LYS2::(lexAop)4-HIS3ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop) 8-ADE2 GAL4 |
■ 基本信息
培養(yǎng)基: | YPD/YPDA |
菌株類別: | 酵母菌 |
培養(yǎng)條件: | 28℃，有氧，YPD/YPDA |
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化: | 化轉(zhuǎn)/電轉(zhuǎn) |
保存方式: | 30%甘油，-80℃ |
基本應(yīng)用: | 酵母雙雜交 |
■ 使用方法
收到菌液及時(shí)四區(qū)劃線活化，挑取單克隆在YPD中培養(yǎng)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)中后期加入終濃度30%無菌甘油保種，分裝置于-80℃保存，避免反復(fù)化凍。建議超凈臺(tái)內(nèi)劃線涂板，避免雜菌污染。
■ 注意事項(xiàng)
1. 酵母菌在YPD培養(yǎng)基上會(huì)變粉，是正?，F(xiàn)象，可以由此特性鑒別是否為酵母菌。
2. 酵母菌種化凍1-2次活性下降，不建議直接長(zhǎng)期保存。
3. 活化保種的種管建議分裝保存，反復(fù)凍融菌株活力下降。
4. 本產(chǎn)品僅可用于實(shí)驗(yàn)室研究，不能用于動(dòng)物，人體以及作為食品添加劑等用途。
5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
